Progettazione di un nuovo chip microfluidico integrato per la separazione continua delle cellule tumorali circolanti dalle cellule del sangue periferico

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 17016 (2022) Citare questo articolo

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Il cancro è una delle principali cause di morte a livello globale. La presentazione in fase avanzata, la diagnosi e il trattamento inaccessibili sono sfide comuni nei paesi sviluppati. Secondo quanto riferito, il rilevamento e il conteggio delle cellule tumorali circolanti (CTC) il più presto possibile possono portare a un trattamento più efficace. L'isolamento delle CTC in fase iniziale è difficile a causa della bassa probabilità della sua presenza nel sangue periferico. In questo studio, proponiamo un nuovo dispositivo di separazione CTC a due stadi, senza etichetta, rapido e continuo basato sulla focalizzazione inerziale idrodinamica e sulla separazione dielettroforetica. La dominanza e la differenza tra la forza di sollevamento inerziale indotta dalla parete e la forza di trascinamento di Dean all'interno di un canale microfluidico curvo determinano una separazione basata sulle dimensioni dei globuli rossi (RBC) e delle piastrine (dimensioni comprese tra 2–4 ​​µm) dalle CTC e dai leucociti (9– 12,2 µm). Un modello numerico è stato utilizzato per studiare il meccanismo della focalizzazione inerziale idrodinamica in un microcanale curvilineo. Sono state effettuate simulazioni con globuli rossi, piastrine, CTC e leucociti (quattro sottotipi principali) per selezionare il valore ottimizzato dei parametri nel disegno proposto. Nella prima fase, è stato studiato il comportamento di focalizzazione delle cellule su microscala per separare i leucociti e le CTC dai globuli rossi, mentre le piastrine mentre le CTC vitali sono state separate dai leucociti in base alle loro proprietà elettriche intrinseche utilizzando la dielettroforesi nella seconda fase. Il progetto proposto del dispositivo è stato valutato per l'efficienza di separazione CTC utilizzando simulazioni numeriche. Questo studio ha considerato l'influenza di fattori critici come proporzioni, forza dielettroforetica, dimensione del canale, portata, efficienza di separazione e forma sulla separazione cellulare. I risultati mostrano che il dispositivo proposto produce CTC vitali con un'efficienza di isolamento del 99,5% con una produttività di 12,2 ml/h.

Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e il Global Cancer Observatory, si prevede che il numero di nuovi casi di cancro all’anno salirà a 29,5 milioni e il numero di decessi correlati al cancro a 16,4 milioni entro il 20401,2. Nella maggior parte dei casi il cancro non viene diagnosticato e trattato finché le cellule tumorali non si sono metastatizzate in tutto il corpo3. Successivamente il paziente recidiva in breve tempo con un tasso di sopravvivenza molto basso. Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che si liberano da tumori primari, recidive o metastasi e circolano nel sangue periferico e possiedono caratteristiche antigeniche e genetiche tumore-specifiche4. Le CTC possono dare origine a una crescita secondaria di tumori in altre sedi del corpo chiamate metastasi4. Le CTC hanno caratteristiche morfologiche e molecolari distinte; iniziano a comparire nel sangue intero in una fase molto precoce dello sviluppo del tumore5. È stato riscontrato che la diagnosi della malattia, il monitoraggio e la terapia personalizzata del cancro possono essere effettuati tenendo un registro delle CTC6. Considerando questo fatto, è essenziale rilevare e valutare le CTC rare (un marcatore non invasivo) per diagnosticare la malattia abbastanza precocemente per un trattamento efficace7. Il conteggio delle CTC dal sangue intero è molto impegnativo a causa della loro scarsità nei pazienti nelle fasi iniziali del cancro, ovvero 1-10 cellule/ml8 rispetto ad altre cellule: 5 × 109 globuli rossi/ml, 2 × 108/ml piastrine e 1 × 106 leucociti9. Sono necessarie CTC vitali per ulteriori analisi del genotipo e del fenotipo a valle per determinare la progressione del cancro. La morfologia eterogenea delle cellule tumorali rende tecnicamente difficile il loro isolamento10. È necessario un dispositivo di smistamento cellulare ad alta sensibilità per caratterizzare e isolare le CTC vitali. Il rilevamento delle CTC nel sangue intero, spesso definito "biopsia liquida", ha attirato l'attenzione della comunità scientifica e clinica11, poiché questo metodo ha potenzialità per la diagnosi, la prognosi e la valutazione dell'efficacia del trattamento12. Ad oggi sono stati ideati diversi metodi per il rilevamento e l'isolamento delle CTC13,14,15,16,17,18,19,20. Le tecniche di isolamento sfruttano le proprietà biofisiche delle CTC che le distinguono dal sangue intero. I selezionatori cellulari microfluidici sono più comunemente usati per scopi diagnostici. La tecnologia microfluidica viene utilizzata per studiare i processi di trasporto dei fluidi nei microcanali. I suoi vantaggi includono dimensioni ridotte del campione, tempi di reazione brevi e basso costo. Per effettuare analisi biologiche sono stati sviluppati dispositivi lab-on-chip (LOC) con funzioni integrate basati sulla stessa tecnologia21,22,23. I selezionatori cellulari microfluidici sono generalmente classificati come attivi o passivi. Le tecniche attive utilizzano la stimolazione esterna come elettrica, magnetica, ottica, acustica e biochimica, ecc.22. Nelle tecniche passive non viene applicata alcuna forza esterna, piuttosto utilizzano proprietà intrinseche come dimensione, forma, architettura del canale e forze idrodinamiche23. Alcune tecniche richiedono l'etichettatura delle CTC prima della separazione24,25. I campioni vengono etichettati utilizzando determinati marcatori della superficie cellulare, ad esempio etichettatura fluorescente, precolorazione, attacco, ecc., per consentire l'enumerazione e la visualizzazione dopo la separazione. L'attenzione dei ricercatori si è concentrata sullo sviluppo di metodi di enumerazione e rilevamento delle CTC, compreso il sistema CellSearch. Grandi sforzi sono stati compiuti utilizzando tecniche di immunomarcatura specifiche per le cellule epiteliali, ad esempio EpCAM o varie citocheratine. Tuttavia, corrono il rischio di perdere le CTC che non esprimono EpCAM o che hanno subito una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)4,26,27.